相傳明永曆十五年（一六六一年）鄭成功自福建湄州請了三尊「軟身寶體媽祖」神像（坐姿高約四尺至四尺四寸）做為護軍之用。一六六四年，鄭成功攻台迫荷蘭人獻城投降後，據民國八年（西元一九一九年）日人所編「台南祠廟名鑑」一書，記載康熙七年（即永曆二十二年，西元一六六八年）鄉民在安平海邊建廟，奉祀媽祖；原址為現今的安平西門國小，名「天妃宮」，為漁民、商旅、負販與安平士民的信仰中心，香火不斷，亦是台灣地區媽祖信仰重鎮。清同治十三年（一八七四年）改稱「天后宮」。
清光緒二十一年（西元一八九五年）甲午戰敗，台灣割讓日本，依據故老相傳，日軍入安平之際，有清軍兵勇多人受困於媽祖宮，慘遭日軍殺戮，屍首竟然埋於廟後空地；神聖殿堂因遭血腥之污，終致香火冷淡、棄置不用。其後日人設立安平公學校，乃以該廟作為教室使用，進而做為日人小學校，餘地終致標售拆毀；主祀的三尊媽祖神像與配祀諸神像被迫寄祀於安平各廟，其中「大媽」祀於廣濟宮，「二媽」祀於靈濟殿，「三媽」祀於妙壽宮。民國五十五年（一九六六年）天后宮在清代安平水師衙門故址（亦是現址）重建。
正殿工程完竣，乃將昔日寄祀於安平各廟的三尊媽祖神像奉請入廟安座，安平人信奉的「媽祖」終得以重興香火。民國六十二年（西元一九七三年）更增建鐘、鼓樓與兩廂，規模更擴大，及至民國六十四年（西元一九七五年）三月，重建工程全部完竣，廟貌宏偉，金碧輝煌；次年三月舉行落成祈安建醮大典，熱鬧非凡。